Первая деревянная церковь Спаса Нерукотворного была возведена еще в 1736 году по указанию императрицы Анны Иоанновны для служащих Конюшенного двора. Раннее на месте церкви было здание, построенное в 1724 году по проекту архитектора Н. Гербеля. Предположительно деревянную церковь на Конюшенной площади построили по проекту Д. Трезини. Освящение храма произошло в 1737 году и в церковь, по просьбе императрицы, из Константинополя были доставлены Образ Спаса Нерукотворного, Плащаницу и икону Знамения.

В 1746 году церковь была перестроена по распоряжению императрицы Елизаветы. В начале 19-го века, в связи с изменяющимся обликом города, церковь была перестроена под руководством архитектора В. Стасова. Был украшен фасад церкви барельефами работы В. Демут-Малиновского.

В 1837 году в церкви Спаса Нерукотворного проходило отпевание знаменитого русского поэта А.С. Пушкина, который был смертельно ранен на дуэли. Особое разрешение на отпевание было получено от Николая I, поскольку церковь была придворной.

В 60-х годах 19 века церковь была перестроена в очередной раз. Руководил строительством архитектор П. Садовников. Было расширено здание, добавлены окна и изменен фасад церкви.

После революции 1917 года церковь была разграблена, а спустя два года закрыта. Библиотека храма была полностью уничтожена, а колокола отправлены на переплавку. В советское время в здании церкви располагались клуб Конной милиции и НИИ «Гидропроект».

Петербургской епархии Конюшенную церковь возвращают в 1991 году. Были проведены реставрационные работы. Специально для церкви Спаса Нерукотворного был отлит колокол – точная копия старинного, уничтоженного после революции.